文献解读｜孕激素通过Id2/Pim1通路减弱Th 17细胞在自身免疫性葡萄膜炎中的致病性

前言

自身免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveitis，AU）是眼科最常见的自身免疫性疾病（autoimmune disease，AD）之一，具有病因复杂、发病率高、致盲率高等特点。以往研究发现女性AU患者在妊娠期间被观察到症状得到缓解，然而孕激素（PRG），作为生殖的关键激素，对AU的治疗和调控机制尚不清楚。

2023年6月21日，中山大学中山眼科中心苏文如教授团队在Journal of Neuroinflammation（lF=9.3）杂志上发表了题为“Progesterone attenuates Th17-cell pathogenicity in autoimmune uveitis via Id2/Pim1 axis”的文章。研究者通过构建实验性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental autoimmune uveitis，EAU）动物模型，首次揭示PRG能用于治疗葡萄膜炎的可行性，并通过分析CDLNs的scRNA-seq数据，探讨了PRG对治疗AU的潜在分子机制。

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作者首先发现PRG能改善EAU模型小鼠的视网膜病变和炎症浸润。进一步通过单细胞测序数据分析发现，PRG可调节Th17/Treg失衡，逆转Id2/Pim1轴、IL-23/ Th17/GM-CSF信号的传导，减弱了Th17的致病性，进而减轻EAU的疾病进展。这项研究提供了PRG治疗对EAU的免疫调节作用的全面单细胞图谱，并阐述了可能的治疗机制，为其治疗自身免疫性疾病的应用提供了新的见解。

结果解读

1.PRG治疗减轻EAU症状和眼内炎症

作者首先构建了小鼠EAU模型，这是AU常用的动物模型，可用于AU的发病机制研究。与EAU小鼠相比，PRG在临床和病理学上改善了疾病体征并降低了炎症评分（图1a，b）。炎性细胞（尤其是病理性T细胞）在眼部的浸润对于病理性损伤至关重要。随后通过流式细胞术，作者发现PRG处理的小鼠中视网膜浸润性CD 45+免疫细胞和CD 4 + T细胞的比例远低于EAU小鼠中的比例（图1c，d）。此外，眼部浸润性IL-17 A+（Th 17）和IFN-γ +（Th 1）CD 4 + T细胞的水平也显示出类似的趋势（图1 e、f）。

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<figcaption style="margin: 5px 0px 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; color: rgb(136, 136, 136); font-size: 14px; line-height: 1.5em; letter-spacing: 0em; text-align: center;">图1 PRG治疗减轻了EAU症状和眼内炎症</figcaption>

2.PRG治疗改变了EAU CDLN中的免疫细胞图谱

CDLN中免疫细胞的激活对于眼内抗原的识别和呈递，对AU患者病情的发生发展至关重要。因此，作者为了阐明PRG治疗作用的潜在分子机制，从未处理的EAU模型小鼠和PRG处理的EAU模型小鼠的CDLN中提取出免疫细胞用于scRNA-seq分析（图2a）。通过严格的数据质量控制后，作者共获得了40，873个细胞（naive，12，586个细胞; EAU，13，307个细胞和PRG处理的EAU模型小鼠，14，980个细胞）用于下游分析。随后，作者基于标记基因，鉴定出了12种主要的免疫细胞谱系，如下所示：BC、CD 4 + T细胞（CD 4）、CD 8 + T细胞（CD 8）、增殖T细胞（Pro-T）、γ δ T细胞（GDT）、T和B细胞（TBC）、NK细胞、浆细胞样DC（PDC）、常规DC（CDC）、单核细胞（MONO）、巨噬细胞（MACRO）和中性粒细胞（NEU）（图2b）。进一步发现，T细胞和BC在CDLN细胞中占主导地位，并且细胞生态系统由EAU和PRG重建（图2c）。

为了鉴定与EAU和PRG治疗相关的分子事件，在EAU模型小鼠和naive小鼠之间（命名为EAU-DEG）以及PRG治疗小鼠和EAU小鼠之间（命名为PRG-DEG）进行了差异表达基因（DEG）分析。在EAU期间，炎症基因（S100家族、AP-1家族）和自身免疫相关基因（Pim 1、Cxcr 4）上调，而与免疫调节相关的基因（Tgfbr 2和Foxp 1）下调（图2d）。这样的改变在PRG治疗后逆转。此外，PRG降低了与细胞活化相关的基因（Cd 69、Cd 28）的表达（图2 e）。接下来，进行基因本体（GO）和通路分析以分析生物学意义。与细胞因子产生、细胞活化和IL-17途径相关的富集过程在EAU期间显著上调，而其通过PRG处理下调（图2f、g）。接下来进行细胞亚群分析，在EAU和PRG处理期间，髓样亚群显示出比其他细胞类型更多的DEG（图2h）。GO分析表明 CD 4中PRG下调的基因在IL-17信号传导途径、炎症途径和Th 17细胞分化中富集（图2i）。在附加文件中，可以看到PRG对其他细胞亚群的影响。总的来说，PRG治疗抑制了EAU小鼠中的几种细胞特异性炎症基因和通路。

PRG处理改变了EAU的免疫细胞谱

3.PRG逆转EAU诱导的PRG相关通路失衡

接下来，作者进一步研究了PRG相关通路是否在EAU模型小鼠中发生改变。通过分析每个亚组中与PRG通路相关的基因的表达，作者发现Stat5b、Foxo1、Afp和Cav1主要在CD 4中表达，而大多数基因在髓样细胞中高度表达，例如NEU中的AP-1家族的基因（图S3 a）。此外，在EAU模型和PRG治疗的EAU模型小鼠中，几个基因发生了改变。Fos、Fosb和Ccl 2的表达在EAU模型小鼠中增加，并且在PRG治疗后降低。值得注意的是，免疫调节基因（Prmt 2，Foxo 1）的相对低表达也被PRG逆转（图S3 b）。此外，作者还使用ELISA验证了三组的血清PRG水平，发现该水平在EAU期间降低，而在PRG治疗后升高（图S3 c）。总的来说，EAU诱导PRG及其相关通路的失衡，而PRG治疗可以恢复这种稳态。

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4.PRG对EAU诱导的基因表达和炎症反应变化的逆转

本节中作者还探讨了PRG对EAU诱导的免疫变化的特异性调节作用。通过EAU-DEG和PRG-DEG的综合比较分析，作者鉴定出了被PRG部分拯救的EAU-DEG，并且这些被称为“rescue DEG”（图3a）。富集分析表明，在EAU期间上调的基因在IL-17和IL-6途径、细胞分化和活化中富集，并且它们的上调被PRG逆转（图3b）。此外，上调的拯救DEG在TGF-β途径和与免疫调节功能相关的几个过程中富集（图3c），表明PRG可以拮抗EAU诱导的免疫调节功能障碍。接下来，探索了拯救DEG在细胞亚群中的细胞类型特异性。如玫瑰图所示，CDC具有最多的救援DEG（图3d）。值得注意的是，炎症和自身免疫基因（Pim1，Cxcr4，AP-1家族）的拯救在超过6个细胞亚群中存在。此外，几种免疫调节基因（Zfp36l1、Txnip、Tgfbr2）的拯救作用在超过四种细胞类型中存在（图3e）。基于拯救DEG与EAU-DEG的比率进一步研究了PRG的拯救作用的细胞特异性（图3f）。CD8、PDC、CD4和BC是具有最高比例的下调的救援DEG的四种细胞类型，相比之下，在CDC中具有最高的上调的拯救DEG比率（图3f）。

作者进一步分析了这些细胞亚群中的救援DEG，在CD8中，EAU增加炎性基因的水平并降低免疫调节基因的表达，这被PRG逆转（图3g）。另外两种具有高比例下调的救援DEG的细胞亚型，BC和CD4，是自身免疫应答和EAU发展的重要介质。BC中下调的救援DEG的GO分析表明，在EAU期间上调的基因在体液免疫应答和BC分化和活化中富集，并且这种表达的增加被PRG抑制（图3 h）。接下来，将BCs细分为五个亚组，幼稚B细胞（NBCs），Isg15+幼稚B细胞（IBC），记忆B细胞（MBC），浆细胞（PC）和germin B细胞（GBC）。PRG处理逆转了EAU诱导的IBC、PC和GBC的积累，它们是参与BC活化的三个关键子集（图3 i）。如Venn图所示，EAU和PRG的作用具有细胞类型特异性。在IBCs中，与抗体应答相关的基因（Jchain，Ighg1）的表达随着EAU增加，而PRG处理后则减少。还鉴定了类似的亚型特异性拯救模式，包括与PC中的BC激活和GBC中的高迁移率族家族相关的基因。在MBC和PC共有的四种基因中，与AP-1家族和抗体应答相关的基因（Mzb1）的表达在EAU组中增加，而在PRG组中减少（图3 j）。总之，这些数据表明，PRG治疗改变了EAU的基因表达和炎症反应。

图3 PRG对EAU诱导的基因表达和炎症反应变化的逆转

5.PRG调节Th17/Treg失衡并增加Treg浸润和抑制功能

CD 4 + T细胞活化和Th 17/Treg失衡在EAU发病中起重要作用，其中Treg是维持免疫稳态的关键因子。GO分析表明PRG可以抑制CD 4 + T细胞中的几种EAU诱导的自身免疫相关途径和过程，例如IL-17信号通路、Th 17分化、淋巴细胞活化和细胞因子产生（附加文件1：图S4 a）。为了探索PRG对CD 4+亚群的影响，将这些细胞分为六个亚组（图4a）。其中，PRG逆转了EAU诱导的Th 17和Th 1细胞亚群的增加，并逆转了Treg细胞的减少（图4 b）。当分析这些子集中的EAU-DEG和PRG-DEG时，作者发现PRG对EAU组的作用比EAU对幼稚组的作用更明显（图4c）。Tregs具有最高比例的上调的救援DEG，表明PRG增加了约40%的下调的EAU DEG的表达（图4 e）。就PRG的下调作用而言，Treg和Th17是受影响最强的在记忆和效应CD 4+亚群中的前两种细胞类型（图4 e）。这些结果表明PRG可以逆转EAU过程中的CD4+ T细胞活化和Th 17/Treg失衡。对Treg亚群进行了详细的分析，发现EAU降低了编码转录因子（TF，包括Id3，Txnip，Foxp1，Foxp3，Bach 2）和受体（Tgfbr1，Tgfbr2，Ccr7）的几个基因的表达，但PRG逆转了这些基因的表达。

此外，作者还发现与EAU相比，PRG上调了几种基因（Tgfb1、Il2ra、Tcf7、Socs 1、Socs 3）（图4f、g）。这些基因与Tregs的分化和免疫调节功能密切相关。富集分析显示上调的救援DEG中与TGF-β信号传导和白细胞分化的负调节相关的途径被富集（图4 h）。综上，PRG治疗EAU后，可增加Treg相关功能分子的表达，改善Th 17/Treg细胞的平衡，这可能是PRG减轻EAU炎症反应的重要机制。

图4 PRG调节Th 17/Treg失衡，促进Treg的频率和功能

6.PRG对EAU诱导的Th17细胞比例和功能因子增加的抑制

Th 17细胞是主要的CD 4 + T细胞亚群，在EAU的发展中发挥关键作用。在Th17细胞中的49种下调的救援DEG中，13种也存在于Treg中，包括参与Th 17功能的关键介质（Bhlhe40和Ccr2）（图5a，b）。这些基因在记忆细胞和效应细胞中高度表达，尤其是Th17和Th1细胞。作者还鉴定了在Th17细胞中高度表达的几种基因，包括介导CD4 + T细胞免疫应答的Id2和在自身免疫和炎症中起关键作用的Fos（图5c）。此外，作者发现PRG逆转了EAU模型小鼠Th17细胞中炎症和自身免疫相关基因（Pim1、S100a10、Hsap8、Jund）水平的升高（图5a、d）。

这些结果表明EAU介导的上调基因和过程与Th17功能相关，PRG处理可以逆转。Id2和Fos通过编码转录因子在免疫应答中发挥重要作用。因此，文中数据中编码TF的“拯救靶基因”通过数据库中TF靶基因与Th17细胞中下调的拯救-DEG的交叉来鉴定（附加文件1：图S5c）。Id2和Fos下游的基因在EAU组的Th17细胞中上调，其被PRG抑制（图5e）。值得注意的是，Id2下游的基因被确定参与炎症反应、IL-17信号传导途径和Th 17细胞分化的调节，而Fos下游的基因在特定的Th 17相关途径中不富集（图5f，g）。这些结果表明Id2可能在Th17细胞分化和功能中起重要作用，并作为PRG干预的关键靶点。与这些发现一致，PRG降低了EAU模型小鼠中Th17细胞的高频率（图5h）。Th17细胞中Pim1和Id2的趋势相同（图5i，j）。

图5 PRG逆转EAU诱导的Th17比例和功能基因的增加

7.PRG通过Id2/Pim1途径减弱EAU中Th 17细胞分化和致病性

基于先前的研究结果，假设Id2及其靶基因在Th17细胞的分化和功能中起重要作用。通过比较数据库中Id2的靶基因与Th17细胞的下调的救援DEG的交叉点，并按重要性鉴定前20个“拯救靶基因”（图6a）。对Th 17细胞的下调的拯救DEG和与T细胞活化、Th 17细胞分化和IL-17信号通路相关的基因进行了表达相关性分析。作者发现，在涉及Id2的相关模块中，Rora和Hif 1a与Th 17细胞分化密切相关，Junb和Jund与IL-17通路密切相关（图6 b）。此外，在Id2的“拯救靶基因”中，Pim1与Id2的相关性最显著（图6 b，c）。这些结果表明，Id2通过Pim1对Th 17细胞起重要的促进作用。为了验证这一假设，进行了体外实验，从EAU模型小鼠中分离出CDLN细胞，并用IRBP1–20或IRBP1–20加HELI（Id 2的抑制剂）对其进行处理。研究证实了HELI降低了CD 4+和Th 17细胞中Id 2的表达（图S6 b，c），表明HELI对Id 2表达的抑制作用。接下来评估了Id2抑制对Th 17细胞占比的影响，发现高占比的Th 17细胞通过HELI处理降低（图6d）。值得注意的是，在加入Id2抑制剂HELI后，Th17来源的Pim1表达也显著降低（图6 e）。因此，EAU中异常的Id2/Pim1通路可能参与了Th 17细胞的分化和葡萄膜炎的致病性，抑制Id2可以改善这种情况。接下来，作者探索PRG是否调节Id2/Pim1通路以减弱Th 17细胞功能。与体内实验的结果一致，PRG处理抑制了IRBP1–20诱导的Th 17细胞分化，并通过添加Id2抑制剂而增强（图S6 d）。类似地，评估Th 17细胞中Id 2和Pim1的水平。IRBP1–20处理增加了Id 2+和Pim1 + Th 17细胞的比例。PRG处理可逆转这些由IRBP1–20诱导的效应，在PRG和HELI共培养后（图6f，g），增强这种抑制作用。此外，GM-CSF是区分致病性Th 17细胞与非致病性Th 17细胞的标志物。在IL-23的刺激下，CD 4 + T细胞表面的IL-23R受体传递信号，促进Th 17细胞的分化和Th 17细胞分泌IL-17、GM-CSF等致病性细胞因子。靶向GM-CSF抑制Th 17细胞致病性并减轻EAU严重程度。流式细胞术表明IL-23R+和GM-CSF + Th 17细胞的比例通过添加IL-23而增加，并且在PRG处理后降低（图S6 e，f）。提示PRG可通过抑制病理性Id 2/Pim1轴和IL-23/Th 17/GM-CSF信号通路，抑制Th 17细胞功能和Au进展。自身反应性IRBP1–20特异性T细胞的转移可诱导EAU发展。为了进一步证实PRG对IRBP1–20特异性T细胞的致病性的抑制作用，作者进行了过继转移（AT）实验。EAU模型小鼠的CDLN细胞用IRBP1–20加入PRG（PRG-AT）或溶媒（溶媒-AT）刺激3天。经IRBP1–20特异性T细胞诱导EAU，而经PRG预处理的细胞不能诱导EAU（图6 h，i）。相应地，与溶媒-AT小鼠相比，PRG-AT小鼠中Id 2+和Pim1 + Th 17细胞的量减少（图S6g，h）。综上，作者发现Id2在EAU发育过程中调节Pim1表达和Th 17细胞功能。PRG治疗可通过抑制病理性Id 2/Pim1轴和GM-CSF信号传导来抑制Th 17细胞分化和致病性，进一步调节Th 17/Treg失衡，导致AU的治疗。

图6 PRG通过Id2/Pim1途径减弱EAU中Th 17分化和致病性

小结

文章主要研究思路如下：

首先通过构建小鼠EAU模型，以及使用PRG进行治疗，证明PRG治疗确实可显著改善EA小鼠视网膜病变和炎性细胞浸润；
随后通过收集CDLN的细胞进行scRNA-seq，构建了正常小鼠，AU小鼠和PRG治疗后的免疫细胞图谱，发现T细胞和BCs是主要变化的细胞类型，且基因转录发生改变；
进一步在对各个细胞亚群中进行差异基因分析和富集分析后，作者得出PRG逆转EAU诱导的与细胞分化、细胞活化和细胞因子信号通路相关的基因表达和自身免疫过程，暗示PRG可挽救EAU诱导的BC活化和体液免疫应答；
在CD 4 + T细胞亚群在EAU的发展中发挥关键作用的背景知识下，进行CD4 T细胞亚群分析，证实了PRG可增加EAU中Th 17的数量和调节功能分子，协调Th 17/Treg失衡;
最后，进一步寻找Th17细胞中高度表达的参与免疫功能的基因，发现Id2可调节Pim1的表达，促进Th 17的致病性；而PRG治疗可逆转Pim1的表达，减轻EAU炎症，治疗AU。

总结:
本篇研究阐明了PRG对EAU治疗作用的分子机制，通过利用单细胞测序分析了孕激素治疗后免疫细胞群的变化，而生信分析和相关实验进一步阐述了可能的治疗机制。最后，作者证实了PRG通过抑制炎症通路和恢复Th 17/Treg平衡来减轻EAU炎症的潜力，确定了Id2/Pim1通路是作为EAU期间Th 17细胞致病性的重要途径，而PRG治疗降低了Id2/Pim1途径的激活和Th 17细胞的分化。综上所述，这项研究拓宽了我们对PRG治疗AU和其他AD的免疫调节机制的理解。